CFTR-correctie door het CRISPR-Cas9-gen in combinatie met een virale vector

Met de CRISPR-Cas9-methode kan een specifieke DNA-sequentie worden geknipt en door een andere worden vervangen. Door het deficiënte CFTR-gen op permanente wijze te corrigeren, kan met deze gentechniek de oorsprong van de ziekte worden behandeld, ongeacht het type en de frequentie van de mutatie. Het CRISPR-eiwit is een voor het immuunsysteem vreemd eiwit. Dit brengt het risico met zich mee dat getransfecteerde cellen worden geëlimineerd als hun expressie niet wordt verlaagd.

Om dit probleem op te lossen, hebben de auteurs een adenovirale vector getest (Helpercel-afhankelijk D-Ad/HD-Ad). Gecombineerd met CRISPR-Cas9 kan deze grote donorgenen (6 tot 8 kb) in de menselijke locus integreren.

Het donor-DNA en het CRISPR-Cas9-systeem werden op doeltreffende wijze gekloond in de plasmidestructuur van de HD-ad-vector, met optimale integratie (10%) van homologe armen van 4 kb, terwijl het minder effectief was bij kortere homologe armen.

De volgende stap was integratie van het CFTR-gen in de menselijke locus middels de HD-Ad-vector. Dit vond plaats in de IB3 en A549-cellen.

De resterende expressie van CRISPR, verantwoordelijk voor de uiteindelijke antigene respons, werd gemeten via PCR en Western blot. Deze was vanaf de negende dag van toediening zeer zwak. Daarentegen was er in 8 tot 10% van de cellen sprake van CFTR-expressie.

Dit onderzoek heeft aangetoond dat de HD-Ad-vector een efficiënte en veilige methode is voor CRISP-Cas9-gemedieerde genintegratie. De eerste in vivo testen op het neusslijmvlies van de muis hebben de effectivieit van de vector aangetoond in het passeren van het respiratoire epitheel ondanks de mucus. De onbekende factor is uiteraard het toedienen in vivo in de bronchiale mucosa bij de mens en de toegankelijkheid van de basale cellen, als ook de doeltreffendheid van transductie; met andere woorden: het percentage CFTR-transcripties dat door getransduceerde cellen wordt hersteld.

Referentie 

CONGRES NACFC 2018 - Donderdag 18 oktober 2018
W08- Advancing Basic Science Toward a "One-Time" CF Cure
Developing a safe method for Crispr-Cas9 mediated CFTR correction
Speakers: Emilia Xia, Université de Toronto